一、實驗原理

　　活性氧簇ROS是由氧分子還原所形成的分子或者離子，大部分都是由線粒體產(chǎn)生的副產(chǎn)物，它們會在細胞代謝包括細胞內(nèi)呼吸和底物氧化過程中產(chǎn)生。適量的ROS是細胞必需的，因為ROS參與維持細胞存活及生理功能所需的各種生活過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達，但過量或過少的ROS都會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，破壞核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和細胞膜等，導(dǎo)致細胞死亡和組織破壞。

　　DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞后，被水解生成DCFH。而DCFH不能透過細胞膜。細胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。DCF被488nm激發(fā)光激發(fā)后，發(fā)射530nm的熒光信號，被FITC通道接收，檢測DCF的熒光就可以判定細胞內(nèi)活性氧ROS的水平。

　　二、實驗步驟

　　1、收集細胞：細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1500 rpm離心5 min收集細胞,棄上清。

　　2、PBS洗滌細胞：加入3ml 4℃預(yù)冷的PBS完全重懸細胞，1500 rpm離心5 min，棄上清。沉淀震蕩混勻。

　　3、細胞計數(shù)：移取10 ul在血細胞計數(shù)儀上進行細胞計數(shù),調(diào)整細胞為1×10^6-2×10^8/ml。

　　4、裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10umol/L。

　　5、孵育探針：37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸，用無血清的培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以去除未進入細胞內(nèi)的探針。

　　6、上機檢測：流式細胞儀使用激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525±20nm進行檢測，用FlowJo軟件分析細胞ROS水平。

　　三、結(jié)果分析

　　結(jié)果說明：平均熒光強度值越大，表明細胞內(nèi)ROS含量越高。