一、實(shí)驗(yàn)原理
活性氧簇ROS是由氧分子還原所形成的分子或者離子,大部分都是由線粒體產(chǎn)生的副產(chǎn)物,它們會(huì)在細(xì)胞代謝包括細(xì)胞內(nèi)呼吸和底物氧化過程中產(chǎn)生。適量的ROS是細(xì)胞必需的,因?yàn)镽OS參與維持細(xì)胞存活及生理功能所需的各種生活過程,如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá),但過量或過少的ROS都會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,破壞核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和細(xì)胞膜等,導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織破壞。
DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞后,被水解生成DCFH。而DCFH不能透過細(xì)胞膜。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。DCF被488nm激發(fā)光激發(fā)后,發(fā)射530nm的熒光信號(hào),被FITC通道接收,檢測DCF的熒光就可以判定細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的水平。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1、收集細(xì)胞:細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中,1500 rpm離心5 min收集細(xì)胞,棄上清。
2、PBS洗滌細(xì)胞:加入3ml 4℃預(yù)冷的PBS完全重懸細(xì)胞,1500 rpm離心5 min,棄上清。沉淀震蕩混勻。
3、細(xì)胞計(jì)數(shù):移取10 ul在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞為1×10^6-2×10^8/ml。
4、裝載探針:按照1:1000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA,使終濃度為10umol/L。
5、孵育探針:37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,每隔3-5 min顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸,用無血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次,以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針。
6、上機(jī)檢測:流式細(xì)胞儀使用激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長525±20nm進(jìn)行檢測,用FlowJo軟件分析細(xì)胞ROS水平。
三、結(jié)果分析
樣本編號(hào) | 平均熒光強(qiáng)度 |
THP-1-nc.fcs | 1395 |
THP-1-rosup.fcs | 6221 |
THP-1.fcs | 18397 |
結(jié)果說明:平均熒光強(qiáng)度值越大,表明細(xì)胞內(nèi)ROS含量越高。
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