項(xiàng)目介紹：

　　1.原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。

　　2.所需器材：

　　脫水機(jī)G-JT12s，包埋機(jī)G-L5/p5,病理切片機(jī)RM2016，凍臺(tái)G-P1，烤箱GFL-70/230,組織攤片機(jī)G-KDP，載玻片及蓋玻片，正置熒光顯微鏡，成像系統(tǒng)，恒溫箱，高壓滅菌鍋，移液槍，鐘擺搖床。

　　3.主要試劑：DEPC。原位雜交固定液。PBS緩沖液。20×SSC洗脫液。蛋白酶K。DAPI?？篃晒獯銣绶馄瑒ｋs交液。

　　石蠟切片熒光探針原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟

　　1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

　　2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

　　3、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h。

　　4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

　　5、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫(huà)圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

　　6、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

　　7、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液, 濃度，恒溫箱度雜交過(guò)夜。

　　8、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

　　9、DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

　　10.鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm,發(fā)藍(lán)光;FAM(488)綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm，發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光。)DAPI染核，為藍(lán)光。

　　注意事項(xiàng)：

　　1.1.mRNA為檢測(cè)對(duì)象時(shí)，需嚴(yán)格要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境經(jīng)無(wú)RNA酶處理。

　　2.FISH切片保存時(shí)間較短，應(yīng)盡快取圖。