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  一、實驗器材及試劑

1、實驗器材

名稱 廠家 型號
脫水機 武漢俊杰電子有限公司 JJ-12J
包埋機 武漢俊杰電子有限公司 JB-P5
病理切片機 上海徠卡儀器有限公司 RM2016
凍臺 武漢俊杰電子有限公司 JB-L5
組織攤片機 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司 KD-P
烤箱 上海福瑪實驗儀器有限公司 DGX-9003B
載玻片及蓋玻片 江蘇世泰實驗器材有限公司 10212432C
水浴鍋 天力醫(yī)療器械有限公司 TL-420D
脫色搖床 北京市六一儀器廠 WD-9405A
渦旋混合器 天悅電子 TYXH-II
移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573
組化筆 Gene tech GT1001
倒置熒光顯微鏡 日本尼康 Nikon Eclipse Ti-SR
成像系統(tǒng) 日本尼康 Nikon DS-U3

2、主要實驗試劑

試劑 廠家 貨號
無水乙醇、二甲苯 國藥集團化學(xué)試劑有限公司
PBS緩沖液 谷歌生物 G0002
蛋白酶K Roche
破膜液 谷歌生物 G1204
DAPI 谷歌生物 G1012
抗熒光淬滅封片劑 谷歌生物 G1401
鹽酸、氨水、雙氧水 國藥集團化學(xué)試劑有限公司
Tunel試劑盒 Roche 11684817910

 

二、石蠟切片tunel實驗步驟

1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。

2、修復(fù):切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止液體流走),在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織,37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。

3、破膜:切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織,常溫下孵育20min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。

4、加試劑1,2:按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按2:29混合,加到圈內(nèi)覆蓋組織,切片平放于濕盒內(nèi),37℃水浴鍋孵育2小時,濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

5、DAPI復(fù)染細胞核:切片用PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。

6、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

7、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

 

 

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