白光tunel檢查試劑盒（DAB)

【產(chǎn)品簡介】

細(xì)胞凋亡中染色體 DNA 的斷裂是個漸進(jìn)的階段性過程。染色體 DNA 首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為 50-300 kb 的大片段，然后大約 30%的染色體 DNA 在 Ca 2+和 Mg 2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成 180-200 bp 核小體 DNA 多聚體。因此在細(xì)胞凋亡晚期，DNA 會被降解為 180-200 bp 的片段，斷裂的基因組 DNA 上暴露出大量的 3′-OH 末端。末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）是一種不依賴于模板的 DNA 聚合酶，可以催化脫氧核苷酸結(jié)合到斷裂的 DNA 分子 3′-OH 末端。因此 TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒可以用來檢測組織細(xì)胞在凋亡晚期過程中細(xì)胞核 DNA 的斷裂情況。其原理是在 TdT 酶的作用下，在基因組DNA 斷裂時暴露出的 3′-OH 末端摻入生物素標(biāo)記的 dUTP（Biotin-dUTP），隨后用辣根過氧化物酶（Horse-radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin）(Streptavidin-HRP,SA-HRP)，檢測被生物素（Biotin）標(biāo)記的 DNA 末端，最后通過加入 HRP 的底物混合液（DAB）進(jìn)行顯色反應(yīng)，使得凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕黃色，從而可以用普通光學(xué)顯微鏡檢測。

本試劑盒可適用于石蠟組織切片的細(xì)胞凋亡檢測。

【儲存與運輸】

冰袋運輸，-20? C 儲存，可穩(wěn)定儲存一年。

【試劑組成】

【使用方法】

石蠟切片熒光 tunel 實驗步驟

石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min，取出置于通風(fēng)廚內(nèi)等酒精晾干后放入自來水中稍洗，蒸餾水洗。(冬天應(yīng)提高脫蠟溫度或適當(dāng)延長脫蠟時間）

通透：PH6.0 檸檬酸修復(fù)液中火修復(fù) 8min ，室溫冷卻，用免疫組化筆劃圈，之后純水洗三次(重要)。（通透方式有多種：1 蛋白酶消化，2tritonx100 通透劑通透，檸檬酸修復(fù)）

配試劑工作液以及孵育：熒光反應(yīng)液（白光 tunel 反應(yīng)液）和 TdT 酶按 50:1 比例混合，此液為 tunel 工作液，，將 tunel 工作液加入到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育 30min 到 2 小時（具體需要預(yù)實驗），濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

白光 tunel，按以下操作：HRP 二抗孵育以及 DAB 顯色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min，然后 HRP 二抗工作液室溫孵育 25min（HRP 二抗工作液，Streptavidin-HRP：PBST=1:1000），；玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min；DAB 反應(yīng)液（客戶自備）顯色;酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

封片：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長 330-380nm，發(fā)射波長 420nm；FITC 綠光激發(fā)波長 465-495nm，發(fā)射波長 515-555 nm；CY3 紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長 590nm）

石蠟切片白光 tunel 結(jié)果判讀 白光 tunel 陽性表達(dá)為黃色至棕黑色，正常細(xì)胞為藍(lán)色。

【注意事項】

1. 本試劑僅供科研。

2. 操作時請穿實驗服，佩戴一次性手套。