鬼筆環(huán)肽（綠光）

【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），又稱(chēng)鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏菌(Amanitaphalloides)中分離到的一種雙環(huán)肽，可以極高的親和力和特異性與肌動(dòng)蛋白絲 F-actin 結(jié)合，不會(huì)結(jié)合單體肌動(dòng)蛋白（G-actin）。鬼筆環(huán)肽對(duì)大小纖維的親和力相近，在許多不同的動(dòng)植物物種的肌肉和非肌肉細(xì)胞中，基本都按照一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計(jì)量比結(jié)合。不像肌動(dòng)蛋白抗體，對(duì)不同物種或來(lái)源的機(jī)動(dòng)蛋白親和力會(huì)發(fā)生明顯變化。鬼筆環(huán)肽的非特異性結(jié)合幾乎可以忽略，染色和未染色區(qū)域的差異非常明顯。鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對(duì) F-actin 染色，可以非常方便的標(biāo)記、識(shí)別和定量研究 F-actin 的分布。本產(chǎn)品為熒光染料 FITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，以 20 μM 儲(chǔ)存液形式提供，溶劑為甲醇。常用濃度范圍 80-200nM，每次染色使用 200 μL 工作液即可。

【儲(chǔ)存與運(yùn)輸】

冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃避光保存；有效期 12 個(gè)月。

【使用方法】

試劑準(zhǔn)備：自備 1×PBS 緩沖液（pH 7.2-7.4），固定液（貨號(hào)：HK2003），細(xì)胞通透劑（貨號(hào)：HKI0048），抗熒光淬滅封片劑（貨號(hào)：HKI0007），即用型 DAPI 染色液（貨號(hào)：HKI0005）等。

工作液配制：用 1×PBS 將本產(chǎn)品稀釋到需要的工作濃度，常用工作濃度為 80-200 nM。推薦使用 100nM，即每 1 μL FITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽與 199 μL PBS 混勻。最佳染色工作濃度請(qǐng)參考文獻(xiàn)或進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索。鬼筆環(huán)肽染色工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

操作步驟

1. 培養(yǎng)好的細(xì)胞爬片（密度至少達(dá)到半?yún)R合），去除培養(yǎng)液，用 37℃預(yù)熱的 1×PBS 緩沖液清洗細(xì)胞清洗細(xì)胞 2 次。

2. 加入含 4%甲醛的固定液覆蓋細(xì)胞，室溫固定 10 min。注意，甲醇能破壞肌動(dòng)蛋白，因此固定液中不得含有甲醇，避免使用含甲醇的甲醛溶液。

3. 用 1×PBS 緩沖液清洗細(xì)胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

4. 用細(xì)胞通透劑覆蓋細(xì)胞，室溫透化細(xì)胞 5-10 min。

5. 用 1×PBS 緩沖液清洗細(xì)胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

6. 細(xì)胞爬片稍微甩干后，用組化筆畫(huà)圈使細(xì)胞位于圈中央。取 200 μL 現(xiàn)配的 FITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色工作液完全覆蓋細(xì)胞，室溫避光孵育 30 min。注意，通常情況下，4-37℃均適合染色。為避免染色工作液揮發(fā)導(dǎo)致干片，孵育過(guò)程需將細(xì)胞爬片置于密封容器內(nèi)，例如避光濕盒。

7. 用 1×PBS 緩沖液清洗細(xì)胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

8. （可選做）向爬片上滴加即用型 DAPI 染色液覆蓋細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞核染色 3-5 min。用1×PBS 緩沖液清洗細(xì)胞 2-3 次，每次 30 s-1 min

9. 細(xì)胞爬片稍甩干后，倒置在滴加一滴抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，用紙巾吸掉對(duì)于封片劑。

【可選步驟】：完成步驟 7 后，直接將蓋玻片倒置在滴加含 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑（貨號(hào)：HKI0007-2）的載玻片上，然后吸掉多余的封片劑。以熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察結(jié)果。

10. 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察結(jié)果，選擇 FITC（Ex/Em=492/518 nm）和 DAPI（Ex/Em=364/454nm）通道。

【注意事項(xiàng)】

1. 熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快完成檢測(cè)及觀(guān)察拍照。

2. 甲醇可以破壞 actin 蛋白，因此樣本前期固定不能使用含有甲醇的固定液。

3. 鬼筆環(huán)肽通常不具有細(xì)胞通透性，極少用于活細(xì)胞染色。

4. 本產(chǎn)品溶劑為甲醇，極易揮發(fā)，每次用完以后需及時(shí)擰緊管蓋密封保存。

5. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，并佩戴一次性手套。