組化雙染試劑盒

【產(chǎn)品簡介】

一抗識別抗原，hrp標(biāo)記二抗識別一抗，hrp催化中間體TY永久性標(biāo)記抗原且實(shí)現(xiàn)信號放大，紅色色原特異性識別TY產(chǎn)物 （共價(jià)結(jié)合），從而實(shí)現(xiàn)了紅色信號的累積，完成了紅色顯色。配合常規(guī)免疫組化用DAB，形成棕色物質(zhì)，棕色與紅色，形成特異的組化雙染顏色。

【儲(chǔ)存與運(yùn)輸】

本試劑需低溫運(yùn)輸，貯存于-20℃低溫環(huán)境，有效期一年

【使用方法】

hrp 二抗孵育完成后，加入即用型 TY 反應(yīng) 20min 左右，然后 PBS 洗三次，之后 加入紅色顯色液工作液(PB:CU:紅色色原AC=860:40:1:100)，反應(yīng) 15 分鐘以上（以上試劑使用前注意解凍為液體狀態(tài)，必要時(shí)混勻離心）。

其他自備試劑：高敏多聚 HRP 組化二抗，一抗，3%過氧化氫，等。

石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精 5min-75%酒精 5min-蒸餾水洗。

抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火 8min至沸，?；?8min 保溫再轉(zhuǎn)中低火 7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。

阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入 3%過氧化氫溶液（30%雙氧水：純水=1:9），室溫避光孵育25 min，將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。

BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用 3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉 30min。

加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加 BSA 按一定比例配好的第一指標(biāo)一抗，切片平放于濕盒內(nèi) 4°C 孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP 標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育 50min。

DAB 顯色：將 DAB 色原與 DAB 緩沖液按 1：100 配制成工作液，玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的 DAB 工作液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。

抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原第二次修復(fù)。中火 8min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）

BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（加固防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用 3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉 30min。

加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的第二指標(biāo)一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi) 4°C 孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP 標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育 50min。

紅色顯色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加預(yù)解凍的 TY 反應(yīng)液反應(yīng) 20min，然后 PBS 洗三次，之后 加入紅色顯色液工作液(PB:CU:紅色色原：AC=860:40:1:100)反應(yīng) 15min，顯微鏡下可控制顯色時(shí)間，陽性為紅色，自來水沖洗切片終止顯色。

復(fù)染細(xì)胞核：Harris 蘇木素復(fù)染 3min 左右，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。

脫水封片：將切片依次放入 75%酒精 6min-85%酒精 6min –無水乙醇Ⅰ6min -無水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

石蠟切片免疫組化結(jié)果判讀：蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，第一指標(biāo) DAB 顯出的陽性表達(dá)為棕黃色，第二指標(biāo)紅色顯色的陽性表達(dá)為紅色或粉紅色。

【注意事項(xiàng)】

1. DAB 顯色盡量不要過深，過深會(huì)影響紅色顯色效果

2.雙染的兩個(gè)抗原 盡量表達(dá)位置不同（如標(biāo)記不同細(xì)胞 或者 不同表達(dá)位置），不適用于兩個(gè)抗原的共定位（不同于熒光的共定位）

3 紅色顯色抗原所對應(yīng)的一抗抗體濃度適當(dāng)提高一些，組化二抗應(yīng)使用高敏多聚二抗。