免疫組化雙染

【產(chǎn)品信息】

• 實驗原理

免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(IHC)或免疫細胞化學技術(ICC)。 

• 實驗器材及試劑

1.主要實驗器材

2.主要實驗試劑

• 實驗步驟
• 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ12min-二甲苯Ⅱ12min -無水乙醇Ⅰ6min- 95%酒精6min- 85%酒精6min，自來水洗2min。
• 抗原修復：組織切片置于盛滿抗原修復液EDTA(9.0)的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復，中火8min至沸騰停火8min再轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
• 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片加上3%的雙氧水，室溫孵育25min，將玻片置PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
• 畫圈：用組化專用的組化筆沿著組織外圍輪廓畫一個與組織間隔3-4毫米的小圈，然后加入足量的PBS保證后續(xù)依次加入的封閉血清，一抗，二抗，以及顯色劑能完全覆蓋組織，而不沿著玻片流走。
• 血清封閉:在組化圈內(nèi)滴加3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
• 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒4°過夜孵育。
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與超敏兔鼠通用二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
• 顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加解凍的TY反應液反應20min，然后PBS洗三次，之后加入紅色顯色液工作液（PB:CU:紅色色原：AC=860:40:1:100），顯微鏡下控制顯色時間，陽性為紅色，純水沖洗切片終止顯色。(時間較長15min左右)，再重復2-7的操作步驟。
• 抗原修復：組織切片置于盛滿抗原修復液EDTA(9.0)的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復，中火8min至沸騰?；?min再轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
• 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片加上3%的雙氧水，室溫孵育25min，將玻片置PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
• 畫圈：用組化專用的組化筆沿著組織外圍輪廓畫一個與組織間隔3-4毫米的小圈，然后加入足量的PBS保證后續(xù)依次加入的封閉血清，一抗，二抗，以及顯色劑能完全覆蓋組織，而不沿著玻片流走。
• 血清封閉:在組化圈內(nèi)滴加3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
• 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒4°過夜孵育。
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與超敏兔鼠通用二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
• DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加（稀釋液和濃縮液1000:50配制）新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。
• 復染細胞核：蘇木素染色2-3mins左右，自來水洗，蘇木素分化液分化2秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍15-30s，流水沖洗。
• 脫水封片：將切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min -95%酒精5min -無水乙醇5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。
• 顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。
• 結(jié)果判讀：

蘇木素染出細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色，紅色顯色試劑呈粉紅色

• 注意事項：

1． 注意切片脫蠟是否徹底；

2． 實驗過程中切片勿干片；

3.  實驗操作中小心槍頭掛傷組織。

2． 實驗過程中切片勿干片；

3.  實驗操作中小心槍頭掛傷組織。