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  一、實驗器材及試劑

  1、實驗器材

名稱 廠家 型號
脫水機 武漢俊杰電子有限公司 JJ-12J
包埋機 武漢俊杰電子有限公司 JB-P5
病理切片機 上海徠卡儀器有限公司 RM2016
凍臺 武漢俊杰電子有限公司 JB-L5
組織攤片機 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司 KD-P
烤箱 上海福瑪實驗儀器有限公司 DGX-9003B
載玻片及蓋玻片 江蘇世泰實驗器材有限公司 10212432C
微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司 P70D20TL-P4
脫色搖床 北京市六一儀器廠 WD-9405A
渦旋混合器 天悅電子 TYXH-II
移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573
組化筆 Gene tech GT1001
倒置熒光顯微鏡 日本尼康 NIKON ECLIPSE TI-SR
成像系統(tǒng) 日本尼康 NIKON DS-U3

  2、主要實驗試劑

試劑 廠家 貨號
無水乙醇、二甲苯 國藥集團化學試劑有限公司  
EDTA(PH8.0)抗原修復液 谷歌生物  
EDTA(PH9.0)抗原修復液 谷歌生物 G1203
檸檬酸(PH6.0)抗原修復液 谷歌生物 G1202
PBS緩沖液 谷歌生物 G0002
BSA solarbio A8020
熒光二抗(FITC、CY3) 谷歌生物  
DAPI 谷歌生物 G1012
抗熒光淬滅封片劑 谷歌生物 G1401

 

  二、石蠟切片免疫熒光實驗步驟

  1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。

  2、抗原修復:組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(PH9.0)的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復。中火至沸后斷電間隔10min中低火至沸,此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。(修復液和修復條件根據(jù)組織來確定)

  3、加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

  4、加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。

  5、DAPI復染細胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。

  6、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

  7、鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

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