一、實驗器材及試劑
1、實驗器材
名稱 | 廠家 | 型號 |
脫水機 | 武漢俊杰電子有限公司 | JJ-12J |
包埋機 | 武漢俊杰電子有限公司 | JB-P5 |
病理切片機 | 上海徠卡儀器有限公司 | RM2016 |
凍臺 | 武漢俊杰電子有限公司 | JB-L5 |
組織攤片機 | 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司 | KD-P |
烤箱 | 上海福瑪實驗儀器有限公司 | DGX-9003B |
載玻片及蓋玻片 | 江蘇世泰實驗器材有限公司 | 10212432C |
微波爐 | 格蘭仕微波爐電器有限公司 | P70D20TL-P4 |
脫色搖床 | 北京市六一儀器廠 | WD-9405A |
渦旋混合器 | 天悅電子 | TYXH-II |
移液槍 | Dragon | KE0003087/KA0056573 |
組化筆 | Gene tech | GT1001 |
倒置熒光顯微鏡 | 日本尼康 | NIKON ECLIPSE TI-SR |
成像系統(tǒng) | 日本尼康 | NIKON DS-U3 |
2、主要實驗試劑
試劑 | 廠家 | 貨號 |
無水乙醇、二甲苯 | 國藥集團化學試劑有限公司 | |
EDTA(PH8.0)抗原修復液 | 谷歌生物 | |
EDTA(PH9.0)抗原修復液 | 谷歌生物 | G1203 |
檸檬酸(PH6.0)抗原修復液 | 谷歌生物 | G1202 |
PBS緩沖液 | 谷歌生物 | G0002 |
BSA | solarbio | A8020 |
熒光二抗(FITC、CY3) | 谷歌生物 | |
DAPI | 谷歌生物 | G1012 |
抗熒光淬滅封片劑 | 谷歌生物 | G1401 |
二、石蠟切片免疫熒光實驗步驟
1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。
2、抗原修復:組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(PH9.0)的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復。中火至沸后斷電間隔10min中低火至沸,此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。(修復液和修復條件根據(jù)組織來確定)
3、加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))
4、加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。
5、DAPI復染細胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。
6、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
7、鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
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