IF+TUNEL雙染

【產(chǎn)品信息】

石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟
1、?石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ12min-二甲苯Ⅱ12min-無水乙醇Ⅰ6min-95%酒精6min-85%酒精6min-蒸餾水洗（冬天脫蠟時(shí)間稍微延長(zhǎng)）。
2、?修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA修復(fù)液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8min?；?min
中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
3、?阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片加上3%的雙氧水，室溫孵育25min，將玻片置PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
4、?血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在組化圈內(nèi)滴加3%BSA?均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
5、?加一抗：切片稍甩干后用在圈內(nèi)滴加按一定比例稀的抗體覆蓋組織。切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。
6、?加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。
7、?信號(hào)放大:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min?。滴加相對(duì)應(yīng)顏色Flare信號(hào)放大試劑，3-5min.將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min?。
8、?修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA修復(fù)液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8min?；?min中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
9、?加試劑tunel工作液：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑TdT酶和反應(yīng)液試劑1:50混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育1.5小時(shí)，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
10、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育
10min。
11、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
12、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm；
FITC綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm）