普通生化檢測（組織）

一、上機生化實驗目的及原理

　　1.肝功能八項：肝功能檢查的目的在于探測肝臟有無疾病、肝臟損害程度以及查明肝病原因、判斷預后和鑒別發(fā)生黃疸的病因等

　　谷丙轉氨酶(ALT/GPT)：

L-丙氨酸+α-酮戊二酸 ^ALT > 丙酮酸+L-谷氨酸

丙酮酸+NADH+H^+ LDH > 乳酸+NAD⁺

在340nm波長測定NADH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性(速率法)

　　谷草轉氨酶(AST/GOT)：

L-天冬門氨酸+α-酮戊二酸 ^AST > 草酰乙酸+谷氨酸

草酰乙酸+NADH ^MDH > 乳酸+NAD⁺

在340nm波長測定NADH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性(速率法)

　　γ-谷氨?；D移酶(GGT)：

γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺+雙甘氨肽 ^r-G > γ-谷氨酰雙甘氨肽+5-氨基-2-硝基甲苯酸，在405nm波長測定每分鐘吸光度的變化率△A/分鐘)，計算其活性(速率法)

　　總膽紅素(T-BIL)：

在PH3左右有表面活性劑和加速劑的條件下，樣品中的總膽紅素被氧化劑釩酸鈉氧化為膽綠素。膽紅素的黃色特異性吸光度下降，通過測定釩酸鹽氧化前后吸光度的變化，計算出樣品中總膽紅素的含量。(兩點終點法)

　　直接膽紅素(D-BIL)：

在PH3左右有表面活性劑和加速劑的條件下，樣品中的直接膽紅素被氧化劑釩酸鈉氧化為膽綠素。膽紅素的黃色特異性吸光度下降，通過測定釩酸鹽氧化前后吸光度的變化，計算出樣品中直接膽紅素的含量。(兩點終點法)

　　堿性磷酸酶(ALP)：

血清中的堿性磷酸酶在堿性條件下作用于對硝基苯磷酸鈉，生成對-硝基酚和磷酸鹽，在405nm波長測定每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性(速率法)

　　白蛋白(ALB)：

在PH4.20左右的條件下，白蛋白分子上的正電荷魚溴甲酚綠上的陰離子集團結合形成綠色的復合物，在630nm波長測定吸光度，計算其含量。(終點法)

　　總膽汁酸(TBA)：

膽汁酸+S-NAD ^3α-HSD > 3-酮類固醇+S-NADH

3-酮類固醇+S-NAGH ^3α-HSD > 膽汁酸+NAD，

不斷完成循環(huán)反應，在405nm波長測定每分鐘S-NADH吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性(兩點速率法)

　　2.腎功能三項：反映腎分泌寄代謝功能

　　尿素/尿素氮(UREA/BUN)：

尿素+H₂O+2H^+ 尿素酶 > 2NH₄⁺ +CO₂

2NH₄+ + α-酮戊二酸+NADH^+ GLDH > 谷氨酸+NAD⁺ +H₂O

在340nm波長測定NADH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其含量(兩點速率法)

　　尿酸(UA)：

尿酸+H₂O+O₂ ^UAO > 尿囊素 +CO₂+H₂O₂

H₂O₂ + 4-AAP+DHBS ^POD > 醌亞胺 +H₂O

在510nm波長測定吸光度值，計算其含量(終點法)

　　肌酐(CREA)：

肌酐+H₂O ^肌酐酶 > 肌酸　　肌酸+H₂O ^肌酐酶 > 肌氨酸+脲

肌氨酸 + H₂O +O₂ ^{肌氨酸氧化酶} > 甘氨酸+HCHO + H₂O₂

2H₂O₂ + 4-AAP+TOOS ^{過氧化物酶} > 紅色醌型化合物 +4H₂O

在546nm波長測定紅色醌型化合物的吸光度值，計算其含量。(兩點終點法)

　　3.血脂四項：

反映血液脂質含量

　　總膽固醇(TC)：

血清中的脂化膽固醇經膽固醇脂酶水解產生游離膽固醇，與原有的游離膽固醇一同被膽固醇氧化酶氧化生成膽甾烯酮和過氧化氫，過氧化氫酶使過氧化氫分解出氧的游離基，它同4-氨基安替比林和酚生成紅色醌型化合物，在510nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　甘油三酯(TG)：

甘油三酯+H₂O ^脂肪酶 > 甘油+脂肪酸

甘油 + ATP ^甘油激酶 > 甘油-3-磷酸+ADP

甘油-3-磷酸+O₂ ^{3-磷酸甘油氧化酶} > H₂O₂+磷酸羥基丙酮

H₂O₂ +4-氨基安替比林+對氯酚 ^{過氧化物酶} > 紅色醌型化合物

在510nm波長下測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)：

通過加入低密度脂蛋白膽固醇的抑制劑，將低密度和極低密度部分隱藏起來，直接測定高密度部分的膽固醇含量。顯色反應原理同總膽固醇，在510nm波長測定吸光值，計算其含量。(終點法)

　　低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)：

低密度脂蛋白包括極低密度脂蛋白，能與磷鎢酸鎂和聚乙二醇復合劑作用產生沉淀，用分散劑可使沉淀顆粒細小均一，在620或630nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　4.血糖：

反映血液糖類含量

　　葡萄糖(Glu)：

血清中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下，生成過氧化氫，用過氧化物酶將過氧化氫分解出氧的游離基，它將4-氨基安替比林和酚氧化為紅色的醌型化合物，在510nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　糖化血清蛋白/果糖胺(GSP)：

GSP上的酮胺結構使氯化硝基氮唑藍(NBT)還原成紫色的甲臜，在546nm波長測定標準和樣品的吸光度變化率(△A/分鐘)，計算其含量。(兩點速率法)

　　5.心肌酶譜：

反映心肌損傷

　　肌酸激酶(CK)：

磷酸激酶+ADP ^CK > 肌酸+ATP+H⁺

葡萄糖 + ATP ^HK > 葡萄糖-6-磷酸+ADP+H⁺

葡萄糖-6-磷酸+NADP^+ G6PDH > 6-磷酸-葡萄糖酸+NADPH+H⁺

在340nm波長測定NADPH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　肌酸激酶同工酶(CKMB)：

用特異抗CK-M抗體將CK-M抑制，測定CK-B的活性，其中包含50%CK-MB的活性，將測定結果乘以2即為CK-MB的活性。

磷酸肌酸+ADP ^CK-B > 肌酸+ATP+H⁺

葡萄糖 + ATP ^HK > 葡萄糖-6-磷酸+ADP+H⁺

葡萄糖-6-磷酸+NADP^+ G6PDH > 6-磷酸-葡萄糖酸+NADPH+H⁺

在340nm波長測定NADPH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　乳酸脫氫酶(LDH-L)：

L-乳酸+NAD^+ LDH-L > 丙酮酸+NADH

在340nm波長測定每分鐘NADH吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　乳酸脫氫酶同工酶(LDH-1)：

L-乳酸+NAD^+ LDH1 > 丙酮酸+NADH+H⁺

在硫氰酸胍抑制劑存在的條件下抑制了LDH2-5，在340nm波長測定每分鐘NADH吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　6.無機離子：

維持體內的電解質、酸堿平衡和滲透壓平衡。

　　鈣(Ca)：

在堿性條件下，鈣離子與鄰甲酚酞絡合酮(OCPC)形成紫紅色復合物，用8-羥基喹啉消除鎂離子的干擾，在578nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　氯(Cl)：

2Cl^– +Hg(SCN)₂       > HgCl₂+2SCN^–

2SCN^– + Fe³⁺        > Fe(SCN)₃

在510nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　無機磷(IP)：在酸性條件下，樣本中的無機磷與鉬酸銨反應生成非還原性磷鉬酸化合物，

　　在340nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　鎂(Mg)：在堿性條件下，鎂離子與染料Calmagite結合，生成紫紅色復合物，在546nm

　　波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　鐵(Fe)：血清中的三價鐵被還原劑還原為二價鐵，二價鐵同菲啰嗪形成紫色的化合物，在578nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　鋅(Zn)：血清中的鋅離子與鋅試劑形成藍色化合物，由于顯色劑本身為紅色，在低含量水平范圍呈紫色，除干擾劑將樣本中的銅離子、鐵離子隱蔽起來，在630nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　鈉(Na)：鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷在鈉依賴性β-D-半乳糖苷酶催化下生成鄰-硝基酚和半乳糖，鄰-硝基酚的生成量和樣品中鈉離子的濃度呈正比。鄰-硝基酚在堿性環(huán)境中呈黃色，可在405nm波長處檢測吸光度的升高速度，計算鈉離子的濃度。(兩點速率法)

　　鉀(K)：血清中的鉀離子在蛋白水解酶的作用下，從蛋白分子的吸附下解脫出來與四苯硼鋰呈濁度反應，在620nm或630nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　7.總蛋白(TP)：

樣本中蛋白質分子的肽鍵與雙縮脲試劑中的銅結合形成紫色化合物，在546nm波長測定吸光度值，計算其含量。(終點法)

　　8.α淀粉酶(AMS)：

Gal-G₂-CNP ^a-AMY > Gal-G₂+CNP

在405nm波長測定每分鐘CNP吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　二、尿常規(guī)相關

　　A、尿常規(guī)檢測項目及意義

　　1、檢測項目：

對尿液中的白細胞(WBC)、酮體(KET)、亞硝酸鹽(NIT)、尿膽原(URO)、膽紅素(BIL)、蛋白質(PRO)、葡萄糖(GLU)、尿比重(SG)、酸堿度(PH)、隱血(BLD)、肌酐(CR)、尿鈣(Ca)、微白蛋白(MA)十三項化學指標進行半定量或定性檢測，為診斷和科研提供參考，適用于篩選試驗或輔助診斷。

　　2、采用干化學法，配套尿液分析儀對尿液中各項待測成分進行檢測，尿液中的各項待測成分可使尿試紙條上相應的試劑塊發(fā)生顏色變化，反應顏色的深淺與尿液中相應待測成分濃度成一定比例關系。通過此方法對泌尿系統(tǒng)疾病、肝膽疾病、糖尿病等疾病進行輔助診斷與療效觀察，尿干化學檢測僅作為篩選試驗，并且不能以此作為單一的診斷方法。

　　B、檢測原理

　　1、空白塊(校正塊)：

尿在測試塊上分布的狀態(tài)及尿本身的顏色一般都會給測定結果帶來誤差，設空白塊就是為了排除這些產生誤差的因素，各項目都使用同一空白塊。

　　2、白細胞：

根據(jù)酯酶法的原理，粒細胞漿內還有酯酶，這種酶能水解一種3-羥基吲哚酚酯類底物，釋放出酚從而與重氮試劑反應生成紫紅色化合物。

　　3、酮體：

根據(jù)硝普酸鈉法原理，硝普酸鈉和酮體(乙酰乙酸)在堿性條件下相互作用而呈現(xiàn)紫色，特別是乙酰乙酸對此特別靈敏。

　　4、亞硝酸鹽：

反應依賴于尿中革蘭氏陰性細菌把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與對氨基苯砷酸反應生成重氮化合物，重氮化合物再與萘基乙二胺二鹽酸結合呈現(xiàn)出桃紅色。

　　5、尿膽原：

根據(jù)偶氮結合法的原理，尿膽原在強酸條件下和重氮鹽偶聯(lián)形成胭脂紅色素。

　　6、膽紅素：

根據(jù)偶氮偶合法的原理，2，4-二氯苯胺重氮鹽與膽紅素進行特異性反應，并與膽紅素的濃度相應產生不同的顏色。

　　7、蛋白質：

根據(jù)染料結合的蛋白誤差法原理，蛋白質與染料結合形成復合物產生色變，特別是對白蛋白的反應比對球蛋白、血紅蛋白、本-周氏蛋白和粘蛋白更為靈敏。

　　8、葡萄糖：

根據(jù)葡萄糖氧化酶法反應原理，葡萄糖氧化酶特異性氧化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖醛酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下，使指示劑氧化而呈現(xiàn)出紫紅色。

　　9、尿比重：

利用多聚電解質方法，尿中電解質與聚電解質發(fā)生離子交換的原理。陽離子存在時，多聚物氫離子通過交換釋出，使溴百里酚藍指示劑發(fā)生顏色變化，顏色由藍經過藍綠最后變成黃色。

　　10、酸堿度：

通過PH指示劑測定5.0-9.0的范圍內的PH值。

　　11、隱血：

根據(jù)血紅蛋白接觸活性法原理，通過血紅蛋白的類過氧化物酶樣作用催化分解過氧化物，使四甲基聯(lián)苯胺氧化呈色。

　　12、肌酐：

根據(jù)肌酐與3,5-二硝基苯甲酸反應產生紫紅色，顏色深淺與肌酐的濃度成正比關系。

　　13、尿鈣：

根據(jù)鈣離子與鄰甲酚酞絡合酮反應產生紫紅色，顏色深淺與鈣離子的濃度成正比關系。

　　14、微白蛋白(微量白蛋白)：

根據(jù)染料結合的蛋白誤差法原理，微量白蛋白與染料結合形成復合物產生色變，對白蛋白的反應靈敏。

　　C、樣本的采集與保存

　　1、留取尿液標本一般應盡量采用新鮮晨尿，因為夜間飲水較少，腎臟排到尿液中的多種成分都儲存在膀胱內并進行濃度，易于查到，提高陽性檢出率，其他隨機留取的尿液也可，但應以留取中段尿為好。

　　2、按排尿的先后測序，可將尿液分為前段、中段、后段。因前段尿和后段尿容易被污染，因此，一般都留取中段尿。

　　3、女性留取尿標本時應避開經期，以防止陰道分泌物混入尿液中，影響檢查結果。

　　D、實驗要求

　　1、樣本要求：

不要在尿樣中加入防腐劑。尿樣不可離心，測試前將尿樣混勻。注射或服用維生素C會使亞硝酸鹽、膽紅素、葡萄糖、隱血檢測結果偏低甚至出現(xiàn)假陰性，應用藥10小時后再進行測定。

　　2、環(huán)境要求：

環(huán)境溫度(25±5)℃，相對濕度≤80%，推薦最佳測試溫度23-27℃。

　　三、凝血相關

　　1、抽取靜脈血，自己配置3.8%(或3.2%)的枸櫞酸鈉抗凝劑：需要按照9份靜脈血、1份抗凝劑的比例取樣，輕輕顛倒10次使之充分混勻，不得有凝塊，不得形成泡沫，離心后提取上清，然后干冰運輸。成品抗凝劑管按抗凝管規(guī)格加入全血量，使其抗凝劑與血液的比例為1：9，舉例：真空采血管中含有3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑約0.2mL，采血至2.0mL。

采樣后應盡快分離血漿(60分鐘內進行)，將標本以3000r/min離心10-15分鐘，使血漿分層，取上層血漿。

　　2、血漿室溫放置，宜在2小時內檢測。血漿若不能及時檢測，分離后的血漿-20℃以下密封可保存2周，干冰運輸。測定前37℃快速融化，輕微混勻后立即檢測。

　　3、對凝固、有凝塊、嚴重溶血、重度黃疸、脂血、采血量不符合要求或無標識等不合格的標本，距采集時間超過2小時并且沒有按要求儲存的樣本，應按照不合格標本處理